Corman-Drosten recenzijsko poročilo

V svetovni znanstveni literaturi je izbruhnila vojna v zvezi s Covid-19 in predlaganim vzročnim virusom. Jedro spora je dejstvo, da so izumitelji RT-PCR testa, ki se na široko uporablja, objavili navodila, kako testirati za SARS-CoV-2, “ne da bi imeli na voljo virusni material”, če uporabimo njihove besede. Namesto tega navodila temeljijo na kitajski znanstvenikovi genetski sekvenci, objavljeni na internetu.

Članek z naslovom “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time PCR” (Povezava do članka) je bil objavljen 24 ur po tem, ko je bil poslan v revijo Eurosurveillance, brez strokovne presoje (peer review). Naslov “članek Corman-Drosten” je dobil po obeh glavnih avtorjih, Christianu Drostenu in Victorju Cormanu. Prinaša navodila za Covid-19 diagnostični test, ki je bil sprejet kot standard za testiranje preko WHO in nenadoma razširjen in uporabljen po svetu.

Nemški znanstvenik Christian Drosten je sodeloval tudi pri odkritju SARS koronavirusa in razvil testiranje zanj leta 2003. Je vodja oddelka za virologijo na inštitutu Charite v Berlinu in vodja skupine znastvenikov v Evropi in Honk Kongu. Odzval se je takoj, ko so se pojavila poročila o primerih bolezni izven Wuhana decembra 2019. Članek je bil oddan 21. januarja 2020 in v reviji Eurosurveillance objavljen 23. januarja 2020 ter preko WHO takoj sprejet kot standard za mednarodno testiranje.

V srhljivih mesecih, ki so sledili, je prišlo do zapiranja držav (lockdown), ekonomskega kolapsa, zapiranja šol in splošne panike. Le peščica je bila seznanjena z veliko količino spornih dejstev v članku, ki je tragično pripomogel do testiranja, ki bi lahko prispevalo med 80 do 97 % lažno pozitivnih rezultatov.

Skupina dvaindvajsetih znanstvenikov je 30. novembra 2020 napisala pismo, v katerem so zahtevali, da se članek Corman-Drosten umakne, (Povezava do pisma) ob tem pa oddali poročilo, v katerem so podali mnenje o desetih kritičnih napakah, ki so jih poimenovali “fatalne”.

Prvi avtor poročila z naslovom “External peer review of the RTPCR test to detect SARS-CoV-2 Reveals 10 Major Flaws At The Molecular and Methodological Level: Consequences For False-Positive Results” je Dr. Pieter Borger, strokovnjak na področju molekularne biologije (https://cormandrostenreview.com).

Prevod poročila v slovenski jezik  

Corman-Drosten recenzijsko poročilo

REVIEW REPORT CORMAN-DROSTEN ET AL. EUROSURVEILLANCE, 2020

MNENJE JE BILO PODANO V IMENU MEDNARODNEGA KONZORCIJA ZNANSTEVNIKOV ZA ŽIVLJENSKE ZNANOSTI (INTERNATIONAL CONSORTIUM OF SCIENTISTS IN LIFE SCIENCES – ICSLS)

Poročilo je bilo uradno poslano v uredništvo Eurosurveillance 27. novembra 2020 preko portala za oddajo. Dodano je bilo pismo z zahtevo za umik članka, podpisano s podpisi vseh avtorjev. Prvo in zadnje ime na seznamu avtorjev sta prvi in drugi glavni avtor, ostali so soavtorji.

Zunanja strokovna presoja RTPCR testa za odkrivanje SARS-CoV-2 je ugotovila 10 večjih znanstvenih napak na molekularnem in metodološkem področju: posledice zaradi lažno pozitivnih rezultatov.

POVZETEK

V publikaciji z naslovom “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR” (Eurosurveillance 25(8) 2020) avtorji predstavljajo diagnostični potek in RT-qPCR protokol za odkrivanje in diagnostiko 2019-nCoV (sedaj znan kot SARS-CoV-2), za katerega trdijo, da je potrjen in uporaben kot zanesljiva diagnostična metodologija za uporabo v laboratorijih javnega zdravja.

Skupina neodvisnih raziskovalcev je v luči vseh posledic za družbo v globalnem pomenu, ki temeljijo na tej publikaciji, opravila natančno recenzijo po posameznih točkah, v katerih so bile 1) navzkrižno preverjene vse komponente dizajna predstvaljenega testa, 2) ocenjena priporočila za protokol RT-qPCR testa kot primer dobre prakse in 3) ocenjeni posamezni parametri glede na relevantne podatke iz znanstvene literature za to področje.

Objavljen protokol RT-qPCR za odkrivanje in diagnostiko 2019-nCoV ter objavljen članek vsebujeta številne tehnične in znastvene napake, vključno z nezadostnim dizajnom primer-ja, problematičnim in nezadostnim RT-qPCR protokolom ter odsotnostjo natančne validacije testa. Predstavljen test, kot tudi članek, ne izpolnjujeta zahtev za sprejem za objavo. Prav tako ni navedenega resnega konflikta interesov avtorjev. In končno, izrazito kratek čas od oddaje do sprejema članka (24 ur) nakazuje, da sistematična strokovna ocena (peer review) bodisi ni bila opravljena ali pa je bila izrazito nekvalitetna. Navajamo prepričljive dokaze mnogih znanstvenih pomanjkljivosti in napak.

Glede na navedene znastvene in metodološke napake predstavljene v tem prispevku smo prepričani, da uredništvo revije Eurosurveillance nima druge izbire, kot da članek umakne.

NATANČNO RECENZIJSKO POROČILO

V našem poročilu navajamo resne napake, opisane v Corman-Drosten članku, zaradi katerih je v svetu prišlo do napačne diagnostike okužb, pripisanih SARS-CoV-2 in povezanih z boleznijo COVID-19. Soočeni smo s strogim zapiranjem držav (lockdown), kar je povzročilo uničenje številnih življenj, obubožanje in omejilo dostop do izobraževanja. S strani vlad odrejene omejitve predstavljajo neposreden napad na človekove osnovne pravice in osebno svobodo, s posledicami kolateralne škode v globalni ekonomiji.

V naslednjih odstavkih bomo natančno izpostavili in pojasnili deset največjih problemov v Corman-Drosten članku.

Prvi in največji problem je novi Coronavirus SARS-CoV-2 (v članku imenovan 2019-nCoV in februarja 2020 v skupini mednarodnega konzorcija strokovnjakov s področja virologije imenovan SARS-CoV-2), ki temelji na teoretičnih sekvencah, priskrbljenih v laboratoriju na Kitajskem [1], saj v tistem času avtorji niso imeli na voljo niti kontrolnega materiala infektivnega (“živega”), niti inaktiviranega SARS-CoV-2, niti izolirane genomične RNA virusa. S strani avtorjev do danes ni bila opravljena validacija, ki bi temeljila na izoliranih SARS-CoV-2 virusih ali njihovi RNA v celotni dolžini.

Glede na zapis v članku Corman et al.: “We aimed to develop and deploy robust diagnostic methodology for use in public health laboratory settings without having virus material available. ” [1]

Tega namena ni možno uresničiti, ne da bi bil na voljo dejanski material virusa (npr. za določitev infektivnosti virusnega bremena). Tako obsežen scenarij je mogoče uresničiti le z izredno natančnim protokolom, ki bi moral biti glavni cilj. Kritična ocena virusnega bremena je nujna informacija in priskrbeti bi jo morala Drostenova raziskovalna skupina, katere odgovornost je izvajanje teh eksperimentov.

Pa vedar, te namišljene sekvence so bile uporabljene za razvoj metodologije RT-PCR testa za identifikacijo omenjenega virusa. Ta model je temeljil na domnevi, da je nov virus zelo podoben SARS-CoV iz leta 2003, saj sta oba beta-koronavirusa.

Ustvarjen je bil PCR test, ki je uporabil genomično sekvenco virusa SARS-CoV kot kontrolni material za Sarbeco komponento; s tem smo seznanjeni na podlagi naše osebne komunikacije z [2] enim od soavtorjev Corman-Drosten članka prek elektronske pošte. Metoda, s katero so ustvarili SARS-CoV-2, je bila opisana v Corman-Drosten članku z:

“The establishment and validation of a diagnostic workflow for 2019-nCoV screening and specific confirmation, designed in absence of available virus isolates or original patient specimen. Design and validation were enabled by the close genetic relatedness to the 2003 SARS-CoV, and aided by the use of synthetic nucleic acid technology.”

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) je pomembna biomolekularna tehnologija za hitro odkrivanje redkih RNA fragmentov, ki so znani že vnaprej. V prvem koraku so molekule RNA, ki so prisotne v vzorcu, reverzno prepisane, da nastane cDNA. Ta je nato pomnožena v verižni polimerazni reakciji, v kateri sodelujeta specifičen par primer-jev in termostabilen DNA polimerazni encim. Tehnologija je visoko senzitivna in teoretično je omejena na odkritje ene molekule cDNA. Na specifičnost PCR izrazito vpliva napaka v biomolekulskem dizajnu.

Kaj je pomembno med dizajniranjem RT-PCR testa in kvantitativnega RT-qPCR testa, opisanega v Cormam-Drosten članku?

1. Primer-ji in vzorci (probes):

• Koncentracija primer-jev in vzorcev mora biti v optimalnem območju (100-200 nM)
• Mora biti specifična za tarčni gen, ki ga hočemo pomnožiti
• Imeti mora optimalen odstotek vsebnosti GC relativno glede na skupno dušikovo bazo (minimum 40 %, maksimum 60 %)
• Za diagnostiko virusa morajo vsaj trije pari primer-jev odkriti tri virusne gene (po možnosti čim bolj narazen v virusnem genomu)

2. Temperatura, pri kateri potekajo reakcije:

• Temperatura tališča DNA (>92 °)
• Temperatura za pomnožitev DNA (TaqPol specifična)
• Tm; temperatura za približevanje (temperatura, pri kateri primer-ji in vzorci dosežejo vezavo s tarčo / ločitev od tarče, ne da bi presegla 2 °C na par primer-jev). Tm je izrazito odvisna od vsebnosti GC v primer-jih.

3. Število pomnožitvenih ciklov (manj kot 35; zaželjeno 25-30 ciklov);

V primeru odkritja virusa se pri več kot 35 ciklih najde le signale, ki ne korelirajo z infektivnim virusom, kot je določeno z izolacijo v celični kulturi; če je nekdo pri PCR testu pozitiven in znaša prag 35 ciklov ali več (kot je primer v večini laboratorijev v Evropi in ZDA), je verjetnost, da je ta oseba dejansko inficirana manj kot 3 %. Verjetnost, da je ta rezultat lažno pozitiven je 97 % [3].

4. Molekularno biološka validacija; pomnoženi PCR produkti morajo biti validirani bodisi z vklapljanjem produktov v gel z DNA ravnilom ali z direktnim DNA sekvencioniranjem

5. Pozitivne ali negativne kontrole naj bi bile specificirane za potrditev / ovrženje detekcije specifičnega virusa

6. Na voljo naj bi bil standarden postopek (Standard Operational Procedure – SOP)

SOP zanesljivo specificira zgoraj navedene parametre, tako da lahko v vsakem laboratoriju zagotovimo enake pogoje za testiranje. Bistevno je, da imamo validiran univerzalen SOP, ker to omogoča primerjavo podatkov znotraj in med državami.

MANJŠI DVOMI V ČLANKU CORMAN-DROSTEN

1. V tabeli 1 v članku Corman-Drosten sta navedeni različni okrajšavi; “nM” je označena, “nm” pa ne. Glede na nomenklaturo kratica nm pomeni “nanometer”, zato naj bi se nm v članku bralo kot nM.
2. Po splošnem dogovoru velja pravilo, da se genetske sekvence vedno zapišejo v smeri 5′-3′, kar velja tudi za reverzne primer-je. V članku Corman-Drosten je izrazito nenavadno to, da je sekvenca primer-jev razvrščena z reverzno komplementarno pisavo, kar je bilo v članku prikazano na sliki 2. Na tem mestu je tudi nedoločena (“wobbly”) baza označena z “y”, brez dodatnega opisa baz, označenih z Y.
3. Zavajajoči dejstvi v članku Corman-Drosten sta tudi dejstvi, da tabela 1 ne vsebuje Tm vrednosti (vrednosti temperature za približevanje), prav tako pa ni GC-vrednosti (število G in C v sekvencah kot odstotek vrednosti skupnega števila baz).

VEČJI DVOMI V ČLANKU CORMAN-DROSTEN

1. UVOD

Avtorji v uvodu navajajo ozadje za njihovo znastveno delo kot “Nastajajoč izbruh novega koronavirusa (2019-nCoV) predstavlja izziv za laboratorije javnega zdravja, ker izolatov virusa ni na voljo, vse več pa je dokazov, da je izbruh bolj obsežen, kot je bilo prvotno mišljeno in da že  obstaja mednarodno širjenje virusa zaradi potovanj. “

Glede na poročila BBC News [4] in Google Statistics [5] je bilo 21. januarja 2020, na dan, ko je bil članek oddan, v svetu zabeleženih 6 smrti. Zakaj so avtorji predvidevali, da bo šlo za izziv laboratorijev javnega zdravja, če v tistem času ni bilo jasnih dokazov, ki bi nakazovali, da bo izbruh obsežnejši, kot je bilo prvotno mišljeno?

Avtorji so namensko razglasili, da bo razvita in nameščena obsežna diagnostična metodologija za uporabo v laboratorijih javnega zdravja, ne da bi bil na razpolago virusni material. V nadaljevanju navajajo “pričujoča študija podaja obsežno razlago, nastalo v sodelovanju med akademskimi in javnimi laboratoriji v nacionalni in evropski raziskovalni mreži.”

2. METODE IN REZULTATI

1. Dizajn primer-ja in vzorca

1a) Napačna koncentracija primer-ja

Natančne in zanesljive protokole PCR testov običajno ustvarijo z uporabo med 100 nM in 200 nM na primer [7]. V članku Corman-Drosten je opazna neobičajno visoka in variabilna koncentracija za nekaj primer-jev (tabela 1). Za par primer-jev RdRp_SARSr-F in RdRp-SARSr-R je navedena koncetracija 600 nM in 800 nM, za par N_Sarbeco_F in N_Sarbeco_R pa priporočena 600 nM in 800 nM [1].

Poudariti je treba, da so te koncentracije bistveno višje od območja, ki bi bilo optimalno za specifično amplifikacijo (pomnožitev) tarčnih genov. Ni posebnega razloga, da v tem protokolu uporabljajo tako ekstremno visoke koncentracije primer-jev. Te koncentracije vodijo do večje količine nespecifičnih vezav in amplifikacije PCR produktov.

Tabela 1: Primer-ji in vzorci. (pridobljeno iz članka Corman-Drosten; obkrožene so napačne koncentracije primer-jev)

1b) Nedoločen (“Wobbly”) primer in sekvence vzorcev

Da bi lahko pridobili ponavljajoče in primerljive rezultate, je nujno potrebno jasno določiti (definirati) pare primer-jev. V članku Corman-Drosten smo našli šest nedoločenih pozicij, označene so s črkami R, W, M in S (tabela 2). Črka W pomeni, da je naj tej poziciji lahko bodisi A ali T; R pomeni, da je tam lahko G ali A; M pomeni, da je pozicija A ali C; S pa, da je na tej poziciji lahko G ali C.

Tako visoko število možnosti je nenavadno in hkrati zelo zavajajoče za laboratorije. Teh šest nedoločenih pozicij bi zlahka lahko povzročilo nastanek nekaj alternativnih sekvenc primer-jev, ki niso v povezavi s SARS-CoV-2 (dva različna RdRp_SARSr_F primer-ja + osem različnih RdRp_SARS_P1 vzorcev + štiri različne RdRp_SARSr_R). Omenjene možnosti neizbežno vodijo v rezultate, ki nedvomno nimajo povezave s SARS-CoV-2. Nejasen, nedoločen opis v članku Corman-Drosten posledično ni primeren za standarden protokol (SOP). Nedoločene pozicije bi morale biti podane nedvoumno.

Zaradi nedoločenih baz je že bilo poslano uredništvu pismo, katerega avtor je Pillonet et al. [8], v katerem omenja očitne napake v opisanih sekvencah. Te napake so jasno vidne tudi v dodatku (supplement) članka Corman et al.

Tabela 2: Primer-ji in vzorci. (pridobljeno iz članka Corman-Drosten; obkroženi so nedoločeni nukleotidi v primer-jih)

WHO protokol, ki neposredno izhaja iz članka Corman-Drosten zaključuje, da je za potrditev prisotnosti SARS-CoV-2 potrebno identificirati pri analizi dva kontrolna gena (E- in RdRp- gen). Navesti je potrebno, da ima RdPd-gen eno negotovo pozicijo v enem napredujočem (forward) primer-ju (R=G/A), dve negotovi poziciji v reverznem (reverse) primer-ju (R=G/A; S=G/C) in tri negotove pozicije v RdRp vzorcu (W=A/T; R=G/A; M=A/C). Posledično se lahko iz gena RdPd sintetizirata dva različna napredujoča primer-ja, štirje različni reverzni primer-ji in osem različnih vzorcev. Skupno je možnih 64 primer-jev in vzorcev!

V članku Corman-Drosten je v nadaljevanju identificiran tretji gen, ki pa glede na WHO protokol ni bil nadalje validiran in je veljal za nepotrebnega:

“Of note, the N gene assay also performed well but was not subjected to intensive further validation because it was slightly less sensitive.”

Opustitev tega gena je bila neprimerna. Najbolje bi bilo uporabiti vse tri PCR gene kot potrditven poskus, kar bi vodilo v skoraj zadostno diagnostično orodje za protokol odkritja virusne RNA. Trije koraki potrditvenega poskusa bi zmanjšali možnost napak in negotovosti pri vsakem koraku glede na  nedoločena mesta.

Kot rečeno, poskus z N genom na žalost ni priporočen niti kot obvezen, niti kot tretji ključni potrditveni korak v WHO-priporočilih (slika 1), prav tako pa v članku Corman-Drosten ni poudarjen kot pomembno opcijsko zagotovilo za rutinsko delo (tabela 2).

Posledično sta bila v skoraj vseh testnih postopkih po svetu uporabljena le dva para primer-jev namesto vseh treh. Zaradi te napake je celoten testni protokol glede natančnosti rezultatov testa v trenutni pandemiji neuporaben.

Slika 1: Potrditven poskus z N genom ni niti poudarjen, kot nujen tretji korak v uradnih priporočilih z WHO Drosten-Corman protokolom [8], niti ni bil naveden kot potreben ključen korak za večjo natančnost testa v publikaciji Eurosurveillance.

1c) Napačna GC-vsebnost (razložena v točki 2c, skupaj s temperaturo za približevanje (Tm))

1d) Detekcija virusnih genov

RT-PCR ni priporočen za primarno diagnostiko okužbe. RT-PCR test, ki se ga uporablja za odkrivanje Covid-19 v klinični praksi, zato kot tak ni indiciran za diagnozo Covid-19.

“Clinicians need to recognize the enhanced accuracy and speed of the molecular diagnostic techniques for the diagnosis of infections, but also to understand their limitations. Laboratory results should always be interpreted in the context of the clinical presentation of the patient, and appropriate site, quality, and timing of specimen collection are required for reliable test results”. [9]

Vendar lahko pomaga zdravniku pri odločitvi glede diferencialne diagnoze med različnimi okužbami pljuč (gripa, Covid-19 in SARS, ki imajo podobne simptome). Za potrditev diagnoze specifičnega virusa je potrebno imeti vsaj tri specifične pare primer-jev za odkritje treh virusu specifičnih genov. Po možnosti naj bi bili ti tarčni geni locirani v virusnem genomu na največji možni razdalji, vključno z nasprotujočima koncema.

Kljub temu, da so v članku Corman-Drosten opisani trije primer-ji, le-ti v groben  pokrivajo le polovico virusnega genoma. To je dodaten faktor, ki zniža specifičnost detekcije intaktne Covid-19 virusne RNA in zvišuje kvoto lažno pozitivnih rezultatov testa.

Torej, tudi če dobimo v vzorcu tri pozitivne signale (trije pari primer-jev dajejo tri različne amplificirane produkte), to ne dokazuje prisotnosti virusa. Boljši dizajn primer-ja bi imel terminalna primer-ja na obeh koncih virusnega genoma. To pa zato, ker bi bil pokrit celoten genom virusa in trije pozitivni signali lahko bolje ločijo med kompletnim virusom (potencialno infektivnim) in fragmentiranim virusnim genomom (brez infektivnega potenciala). Za kakršnokoli sklepanje o pomenu infektivnosti virusa bi moral biti kot tarča vključen tudi Orf1 gen, ki kodira esencialni encim replikaze virusa SARS-CoV (slika 2). Pozicija tarč v regiji virusnega genoma, ki je variabilno prepisana (transcribed), je dodatna šibkost protokola.

Kim et al. je prikazala visoko variabilnost 3′ ekspresije subgenomske RNA v SARS-CoV-2 [23]. Te RNA opazujejo kot podpis za asimptomatske in neinfektivne bolnike [10]. Zelo vprašljivo je opravljanje screeninga na populaciji asimptomatskih ljudi s qPCR primer-ji, ki imajo šest baznih parov primer-dimer na 3′ koncu primer-ja (slika 3).

Očitno WHO te primer-je priporoča. Z orodjem Thermofisher’s primer dimer web smo testirali vse nedoločene derivate, navedene v članku Corman-Drosten. Napredujoči (forward) primer RdRp je 6bp 3prime homolog s Sarbeco E Reverse. Pri visoki koncentraciji primer-ja je to dovolj za nenatančnost.

Opomba: obstaja popoln par enega od N primer-jev patogenu (Pantoea), najden pri imunsko-kompromitiranih bolnikih. Reverzni primer je tudi v stiku z njim, vendar ne v isti regiji (slika 3).

Navedene so drastične napake v dizajnu, saj test ne uspe ločiti med celotnim virusom in virusnimi fragmenti. Test ne more biti uporabljen kot diagnostičen za SARS viruse.

Slika 2: Relativne pozicije amplikonovih tarč na SARS koronavirusu in genom novega 2019 koronavirusa. ORF: open reading frame; RdRp: RNA-dependent RNA plymerase. Številke pod amplikonom so pozicije genoma glede na SARS-CoV, NC_004718 [1].

Slika 3:  Test s Thermofisher primer dimer web tool razkrije, da je RdRp napredujoč (forward) primer 6bp 3′ prime homologen s Sarbeco E Reverse (levo). Drugi test razkrije popolno ujemanje enega od N-primer-jev s kliničnim patogenom (Pantoea), najdenim pri imunsko-kompromitiranih bolnikih (desno).

2. Reakcijske temperature

2a) Temperatura tališča DNA (>92 ° )

Primerno opisano v članku Corman-Drosten.

2b) Temperatura amplifikacije (pomnožitve) DNA

Primerno opisano v članku Corman-Drosten.

2c) Napačna GC-vsebnost in Tm

Temperatura za približevanje določa, pri kateri temperaturi se primer veže / sprosti od tarčne sekvence. Za zadostno in specifično amplifikacijo mora biti GC-vsebnost primer-jev najmanj 40 % in največ 60 %. Kot je razvidno iz tabele 3, v članku Corman-Drosten trije izmed opisanih primer-jev niso v normalnem območju GC-vsebnosti. Dva primer-ja (RdRp_SARSr_F in RdRp_SARSr_R) imata nenavadno in zelo nizko GC-vrednost (28 % – 31 %) za vse možne variante nedoločenih baz, primer E_Sarbeco_F pa ima GC-vrednost 34.6 % (tabela 3).

Omeniti je potrebno, da GC-vsebnost v veliki meri določa njegovo vezavo na specifično tarčo zaradi treh njegovih vodikovih vezi med baznimi pari. Nižja kot je GC-vsebnost primer-ja, nižja je njegova sposobnost vezave na njegovo specifično tarčno gensko sekvenco (gena, ki naj bo odkrit). Da je tarčna sekvenca prepoznana je potrebno izbrati temperaturo, ki je čim bližje dejanski temperaturi za približevanje, da ne bi prišlo do ponovne sprostitve primer-ja, hkrati pa naj bi primer specifično izbral tarčno sekvenco.

V primeru, da je Tm vrednost zelo nizka, kar je opazno za vse nedoločene variante RdRp reverznih primer-jev, se primer-ji lahko vežejo nespecifično na mnoge tarče, kar znižuje specifičnost in povišuje potencialno lažno pozitivne rezultate.

Temperatura približevanja (Tm) je ključni dejavnik za določitev specifičnosti / natančnosti qPCR postopka in nujen za evaluacijo natančnosti qPCR protokolov. Priporočilo najboljše prakse: oba primer-ja (napredujoč in reverzen) naj bi imela skoraj enako vrednost, po možnosti celo identično. Za oceno vrednosti najboljše prakse za vse primer-je, navedene v članku Corman-Drosten smo uporabili prosto dostopen software za dizajn primer-ja Primer-BLAST [12, 25]. Poskušali smo doseči Tm-vrednost 60 °C in podobno iskali najvišji možni % GC-vrednosti za vse primer-je. Sprejemljiva je bila maksimalna Tm razlika 2 °C med pari primer-jev. Z enakim postopkom smo testirali pare primer-jev, navedenih v članku Corman-Drosten in opazili razliko 10 °C v temperaturi približevanja Tm za par 1 primer-ja (RdRp_SARSr_F in RdRp_SARSr_R). Gre za zelo hudo napako, zaradi katere je ta protokol kot specifično diagnostično orodje neuporaben.

Dodatno testiranje je pokazalo, da je standardom za diagnostični test zadostil le par primer-jev, dizajniran za amplifikacijo N-gena (N_Sarbeco_F in N_Sarbeco_R), saj ima zadostno GC-vsebnost ter Tm razliko med primer-jema, ki znaša 1.85 °C. Pomembno je, da imenovan N-gen ni bil testiran v vzorcih virusa (tabela 2), niti poudarjen kot potrditveni test. Poleg visoko variabilnih temperatur tališča in degeneriranih sekvenc teh primer-jev obstaja še en dejavnik, ki vpliva na specifičnost postopka: dNTP-ji (0.4uM) so dvakrat višji kot je priporočeno za visoko specifično amplifikacijo. Prav tako je reakciji dodan magnezijev sulfat. Ta postopek, kombiniran z nizko temperaturo približevanja, lahko ustvari nespecifične amplifikacije. V primeru , da je za qPCR potreben dodaten magnezij, naj bi bila specifičnost testa še natančneje preiskana.

Navedene napake v dizajnu so tako hude, da je praktično nemogoče, da bi z uporabo protokola iz članka Corman-Drosten do amplifikacije SARS-CoV-2 genetskega materiala sploh prišlo.

Tabela 3: GC-vsebnost primer-jev in vzorcev. (pridobljeno iz članka Corman-Drosten; obkroženi so odkloni od optimalnih GC-vsebnosti. V spodnji tabeli je naveden seznam vrednosti najboljše prakse glede na software Primer-BLAST za vse primer-je in vzorce, uporabljene v članku Corman-Drosten (prof. dr. Ulrike Kämmerer in njen tim)

3. Število podvojitvenih ciklov

V članku Corman-Drosten ni nikjer navedeno, ali je test pozitiven ali negativen oziroma kaj definira pozitiven ali negativen rezultat testa. Ta vrsta viroloških diagnostičnih testov mora temeljiti na SOP, vključujoč validirano in fiksno število PCR ciklov (Ct vrednost), po katerih je vzorec ocenjen kot pozitiven ali negativen. Maksimalna zanesljiva Ct vrednost je 30 ciklov. Nad tem številom ciklov je pričakovati hiter porast števila lažno pozitivnih testov.

Ocena PCR podatkov kot pozitivnih ob Ct vrednosti 35 ciklov ali več je popolnoma nezanesljiva.

Če citiramo Jaafar et al. 2020 [3]: “Pri Ct = 35, vrednost, ki smo jo uporabili za opredelitev PCR testa kot pozitivnega, je pozitivnih < 3 % kultur.” Drugače rečeno, pri teh visokih Ct vrednostih SARS-CoV-2 virusa niso uspešno izolirali.
Znanstvene študije dokazujejo, da so s Ct vrednostmi 35 lahko odkriti le neinfektivni (mrtvi) virusi [22].

Med 30 in 35 obstaja siva cona, kjer pozitivnega testa ni možno zagotovo dokazati. To območje bi moralo biti izključeno. Možno bi bilo opraviti 45 PCR ciklov, kot je priporočeno v Corman-Drosten WHO protokolu (slika 4), vendar naj bo v tem primeru določena razumna Ct-vrednost (naj ne bi presegla 30). Analitičen rezultat s Ct-vrednostjo 45 je znanstveno in diagnostično popolnoma brez pomena (razumna Ct-vrednost naj ne bi presegla 30), kar mora biti jasno poudarjeno.

Dejstvo, da v članku Corman-Drosten ni omenjene maksimalne Ct-vrednosti, pri kateri je vzorec nedvoumno označen kot pozitiven ali negativen rezultat testa, je velika napaka. Omejitve števila ciklov niso navedene niti v katerem od popravkov, ki so sledili.

Slika 4:  RT-PCR Kit priporočilo v uradnem Corman-Drosten WHO protokolu [8]. Navedena je le vrednost ciklov brez odgovarjajoče in znanstveno utemeljene Ct-vrednosti (Cutoff-vrednosti). Te ali druge vrednosti ciklov v članku Corman-Drosten niso navedene.

4. Biomolekulske validacije

Biomolekulska validacija (ocena) pomnoženih PCR produktov mora biti nujno opravljena, če želimo dokazati, da so pomnoženi produkti resnično SARS-CoV-2 geni. Za diagnostičen test je ta validacija absolutno nujno.

Validacija PCR produktov naj bi bila opravljena z vklopitvijo PCR produkta v 1 % agaroza-EtBr gel, skupaj z indikatorjem velikosti (DNA merilo ali DNA lestvica), tako da je možno oceniti velikost produkta. Velikost mora odgovarjati izračunani velikosti amplificiranega produkta. Boljša možnost je sekvencioniranje amplificiranega produkta, s čimer ugotovimo identiteto le-tega v 100 %. O identiteti amplificiranega PCR produkta ne moremo biti prepričani, če ne opravimo molekularne validacije. Glede na hude napake v dizajnu, opisane v prejšnjih točkah, so amplificirani produkti lahko karkoli.

Majhni fragmenti qPCR (okoli 100bp) v članku Corman-Drosten niso omenjeni. Lahko bi bili 1.5 % gel agaroze ali celo akrilamidni gel.

Dejstvo, da PCR produkti niso bili validirani na molekularnem nivoju, je še ena velika napaka tega protokola, zaradi česar je vsak test, ki temelji na tem protokolu kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa popolnoma neuporaben.

5. Pozitivne in negativne kontrole za potrditev / ovrženje detekcije specifičnega virusa

V članku Corman-Drosten je navedena nepotrjena domneva, da je SARS-CoV-2 edini virus iz skupine SARS-podobnih beta-koronavirusov, ki trenutno povzroča okužbo pri ljudeh. Sekvence, na katerih temelji njihova PCR metoda so v silico sekvencah, ki jih zagotavlja laboratorij iz Kitajske [23], saj v času razvoja PCR testov avtorji niso imeli na razpolago kontrolnega materiala infektivnega (“živega”) ali inaktiviranega SARS-CoV-2. PCR test je bil torej dizajniran z uporabo sekvence znanega SARS-CoV kot kontrolni material za Sarbeco komponento (Dr. Meijer, soavtor članka Corman-Drosten v elektronski pošti z Dr. Pietrom Borgerjem) [2].

Vse osebe s pozitivnim RT-PCR testom, kot opisano v članku Corman-Drosten, so domnevno pozitivne za SARS-CoV-2 okužbo. V njihovi domnevi so tri velike napake. Prvič, pozitivnega testa za RNA molekule, opisanega v članku Corman-Drosten, ni možno enačiti z “okužbo z virusom”. Kot je bilo prikazano zgoraj v točki 1d), Corman-Drostenov test ni bil dizajniran za detekcijo celotnega virusa, temveč le fragmenta virusa. Zaključili smo že, da to pomeni, da je test kot tak neprimeren diagnostičen test za SARS virusno okužbo.

Drugič, kar je najpomembnejše, funkcionalnost objavljenega RT-PCR testa ni bila opredeljena z uporabo pozitivne kontrole (izoliran SARS-CoV-2 RNA), kar velja za zlati standard.

Tretjič, v članku Corman-Drosten je navedeno:

“To show that the assays can detect other bat-associated SARS-related viruses, we used the E gene assay to test six bat-derived faecal samples available from Drexler et al. […] und Muth et al. […]. These virus-positive samples stemmed from European rhinolophid bats. Detection of these phylogenetic outliers within the SARS-related CoV clade suggests that all Asian viruses are likely to be detected. This would, theoretically, ensure broad sensitivity even in case of multiple independent acquisitions of variant viruses from an animal reservoir.”

Iz izjave je razvidno, da E gen uporabljen v RT-PCR testu ni specifičen za SARS-CoV-2, kot je opisano v članku Corman-Drosten.

Primer-ji E gena odkrivajo tudi širok spekter drugih SARS virusov. Genom koronavirusa, ki okuži človeka, je najobsežnejši med vsemi RNA virusi in vsi imajo zelo podobno molekularno strukturo. Pa vendar imata SARS-CoV1 in SARS-CoV-2 dva visoko specifična genetska prstna odtisa, kar ju ločuje od drugih koronavirusov. Prvič, unikatna sekvenca (KTFPPTEPKKDKKKK) je prisotna na N-proteinu SARS-CoV in SARS-CoV-2 [13, 14, 15]. Drugič, SARS-CoV1 in SARS-CoV-2 ne vsebujeta HE proteina, medtem ko vsi ostali koronavirusi imajo ta gen [13, 14]. Da bi specifično odkrili PCR produkt SARS-CoV1 in SARS-CoV-2, bi morala biti izbrana zgoraj omenjena regija v genu N kot amplifikacijska tarča. Zanesljiv diagnostičen test bi moral biti usmerjen v to specifično regijo na N genu, da bi to lahko bil test za potrditev. PCR za ta N gen kot testni gen v nadaljevanju ni bil validiran, niti priporočen v članku Corman-Drosten, ker naj ne bi bil senzitiven s SARS-CoV originalnim vzorcem [1].

Še več, odsotnost HE gena v obeh SARS-CoV1 in SARS-CoV-2 omogoča, da je ta gen idealna negativna kontrola za izključitev drugih koronavirusov. Članek Corman-Drosten ne vsebuje te negativne kontrole, niti ne katere druge. PCR test v članku Corman-Drosten ne vsebuje niti unikatne pozitivne kontrole, niti negativne kontrole za izključitev prisotnosti drugih koronavirusov. To je še ena velika napaka v dizajnu, zaradi katere test ni primeren za diagnozo.

6. Standardnega operativnega postopka (SOP) ni na voljo

Standardni operativni postopek (SOP) bi moral biti na voljo, saj specificira zgoraj navedene parametre, tako da vsi laboratoriji lahko pripravijo identične pogoje za testiranje. Validiran univerzalen SOP je nujen, saj olajša primerjavo podatkov v in med državami. Natančno specificiranje vseh parametrov je bistvenega pomena, kar pa ni bilo narejeno. Tudi Ct vrednost za identifikacijo, kdaj je vzorec pozitiven ali negativen, ni specificirana. Prav tako ni specificirano, kdaj se vzorec smatra za okuženega s SARS-CoV virusi. Kot omenjeno zgoraj, test ne loči med virusom in virusnimi fragmenti, zato je  Ct vrednost, ki nakazuje pozitiven rezultat, ključnega pomena. Ta Ct vrednost bi morala biti specificirana v SOP in objavljena, tako da bi imeli vsi laboratoriji, ki izvajajo ta test, popolnoma enake pogoje.

Ker tak SOP ne obstaja, to nakazuje na napačno znanost. Laboratorijem je tako prepuščeno, da izvajajo test kot se jim zdi primerno, kar vodi v veliko število variacij. V laboratorijih v Evropi so ostala številna vprašanja; katere primer-je naročiti?, katere nukleotide namestiti na neopredeljena mesta?, katero Tm vrednost izbrati?, koliko PCR ciklov opraviti?, pri kateri Ct vrednosti je vzorec pozitiven?, kdaj je vzorec negativen?, koliko genov testirati?, naj bi bili vsi geni ali le E in RpRd gen, kot je prikazano v tabeli 2 članka Corman-Drosten?, ali naj bi bil testiran tudi N gen?, kaj je njihova negativna kontrola?, kaj je njihova pozitivna kontrola?

Protokol kot tak je na žalost zelo nejasen in poln napak v dizajnu, kar vodi v številne različne smeri. V članku ni niti standardizacije, niti SOP, zato ni jasno, kako naj se ta test izvaja.

7. Posledice napak, opisanih v točkah 1-5: lažno pozitivni rezultati

RT-PCR test opisan v članku Corman-Drosten vsebuje toliko molekularno bioloških napak v dizajnu (glej 1-5), da ni možno dobiti nedvoumnih rezultatov. Neizbežno je, da ta test povzroči ogromno število tako imenovanih “lažno pozitivnih” testov. Po definiciji lažno pozitivnih je vzorec negativen, če je sprva rezultat pozitiven, vendar je kasneje negativen pri ponovnem testiranju z enakim testom. Lažno pozitivni so napačno pozitivni rezultati testov, pomeni negativen vzorec, ki je na testu pozitiven. Prav to je najdeno v članku Corman-Drosten. V PDF članku na strani 6 avtorji prikazujejo, da celo v dobro nadzorovanih pogojih laboratorija nastane sorazmerno visok delež lažno pozitivnih rezultatov s tem testom:

“In four individual test reactions, weak initial reactivity was seen however they were negative upon retesting with the same assay. These signals were not associated with any particular virus, and for each virus with which initial positive reactivity occurred, there were other samples that contained the same virus at a higher concentration but did not test positive. Given the results from the extensive technical qualification described above, it was concluded that this initial reactivity was not due to chemical instability of real-time PCR probes and most probably to handling issues caused by the rapid introduction of new diagnostic tests and controls during this evaluation study.” [1]

Prvi stavek tega izvlečka je jasen dokaz, da PCR test opisan v članku Corman-Drosten ustvarja lažno pozitivne rezultate. Celo v dobro nadzorovanih pogojih vrhunskega laboratorija Charite po definiciji pri 4. od 310 primarnih testov dobimo lažno pozitivne rezultate. Štirje negativni testi so bili sprva testirani pozitivni, potem pa pri ponovnem testiranju negativni. To je klasičen primer lažno pozitivnega. V tem primeru avtorji testa niso opredelili kot lažno pozitivnega, kar je intelektualno nepošteno.

V zgornjem izvlečku je še ena opazka, v kateri avtorji razlagajo lažno pozitivnost kot “nastajajoč problem, povzročen zaradi hitrega uvajanja novega diagnostičnega testa”. Predstavljajte si laboratorije, ki morajo uvajati test brez vseh potrebnih informacij, običajno navedenih v SOP.

8. Članek Corman-Drosten ni bil strokovno pregledan (peer-reviewed)

Znanstveni ali medicinski članki so pred objavo v strokovni reviji strokovno pregledani in potrjeni za objavo v postopku imenovanem “peer review”. Pri tem postopku uredniki revije za mnenje prosijo ustrezne strokovnjake (recenzente), ki ocenijo prispevek in navedejo slabosti v predpostavkah, metodah in zaključkih. Revija objavi članek le v primeru, ko uredniki sklenejo, da so avtorji popravili članek skladno s predlogi recenzentov in da podatki predstavljeni v članku utemeljujejo zaključke članka. Ta postopek velja tudi za revijo Eurosurveillance [16].

Članek Corman-Drosten je bil oddan v revijo Eurosurveillance 21. januarja 2020 in sprejet za objavo 22. januarja 2020. 23. januarja 2020 je bil članek objavljen na internetu (online). 13. januarja 2020 je bila na uradni internetni strani WHO objavljena 1-0 verzija protokola [17], posodobljena 17. januarja 2020 kot dokument verzija 2-1 [18], celo pred objavo članka Corman-Drosten v reviji Eurosurveillance.

Peer review postopek zahteva svoj čas, saj morata kritično prebrati / obdelati članek in podati svoje mnenje vsaj dva strokovnjaka z ustreznega področja. Menimo, da članek Corman-Drosten ni bil deležen tega postopka, saj v štiriindvajsetih urah tega postopka ni možno opraviti. Našo domnevo podpira dejstvo, da smo v članku našli veliko število zelo resnih napak v dizajnu PCR testa, zaradi česar je ta test popolnoma neprimeren kot diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa. Vsak molekularni biolog, seznanjen z dizajnom RT-PCR testa bi brez težav našel hude napake v članku Corman-Drosten, preden bi le-ta sploh bil predan v postopek strokovne ocene. Revijo Eurosurveillance smo 26. oktobra 2020 prosili, da nam pošlje kopijo peer review poročila. Do danes tega poročila nismo prejeli. V pismu 18. novembra 2020 je gostitelj / prireditelj v imenu Eurosurveillance odklonil našo prošnjo za vpogled v poročilo z razlago, da bi v primeru razkritja to povzročilo razvrednotenje znanstvene raziskave [24].

9. Avtorji kot uredniki

Zadnja točka vzbuja največjo skrb. Izkazalo se je, da sta dva avtorja članka Corman-Drosten (Christian Drosten in Chantal Reusken) tudi člana uredništva revije Eurosurveillance [19]. Gre torej za hud konflikt interesov, ki podkrepi sum, da članek ni bil strokovno pregledan (peer reviewed). To dejstvo nakazuje, da je bil članek hitro objavljen zato, ker sta avtorja tudi člana uredništva iste revije. Takšno ravnanje spodbija integriteto znanosti.

SEZNAM NAPAK V ČLANKU CORMAN-DROSTEN

1. Za tako ekstremno visoko koncentracijo primer-jev v protokolu ni jasnega razloga. Opisane koncentracije vodijo v povečanje nespecifičnih vezav in v amplifikacije (pomnožitev) PCR produkta, zaradi česar je test neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
2. Šest nedoločenih pozicij povzroči enormno variabilnost v primeru uporabe testa v laboratoriju v resničnem svetu; nejasen in nespecifičen opis v članku Corman-Drosten ni primeren za standardni operacijski protokol, zaradi česar je test neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
3. S testom ni možno ločiti, ali gre za celoten virus ali fragmente virusa. Test zato ne more biti uporabljen za diagnostiko intaktnih (infektivnih) virusov in je neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa in neprimeren za sklepanje glede prisotnosti okužbe.
4. Razlika 10 °C v temperaturi za približevanje Tm za par primer-jev (RdRp_SARSr_F in RdRp_SARSr_R) prav tako naredi test neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
5. Velika napaka je opustitev navedbe, pri kateri Ct vrednosti je vzorec pozitiven oziroma negativen. Ct vrednost prav tako ni navedena v verzijah oddanih kasneje, zaradi česar je test neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
6. PCR produkti na molekularnem nivoju niso bili validirani. To dejstvo naredi test neuporaben kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
7. PCR test ne vsebuje niti unikatne pozitivne kontrole za oceno njegove specifičnosti za SARS-CoV-2, niti ne negativne kontrole za izključitev prisotnosti drugih koronavirusov, zaradi česar je test neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
8. Dizajn testa v članku Corman-Drosten je tako nejasen in napačen, da usmeri v številne različne smeri; nič ni standardizirano, prav tako ni standardiziranega operativnega postopka (SOP). To pod vprašaj postavi znanstveno vrednost testa in naredi test neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
9. Članek Corman-Drosten najverjetneje ni bil strokovno pregledan (peer reviewed), zaradi česar je neprimeren kot specifično diagnostično orodje za identifikacijo SARS-CoV-2 virusa.
10. Našli smo hud konflikt interesov za (vsaj) štiri avtorje članka. Dva avtorja (Christian Drosten in Chantal Reusken) sta člana uredništva revije Eurosurveillance. Konflikt interesov je bil dodan 29. julija 2020, saj ni bil naveden v originalni verziji (še vedno ni naveden v PubMed verziji). Olfert Landt je CEO (generalni direktor) pri TIB-Molbiol, Marco Kaiser pa je nadzorni raziskovalec pri GenExpress in svetovalec za TIB-Molbiol. TIB-Molbiol je podjetje, ki je prvo proizvedlo PCR kits (Light Mix), ki temelji na protokolu objavljenem v članku Corman-Drosten in kot so povedali sami, so pričeli z distribucijo tega izdelka še preden je bil članek oddan v revijo [20]. Victor Corman in Christian Drosten delata tudi v laboratoriju za komercialno testiranje (Labor Berlin). Tam sta oba odgovorna za diagnostiko virusov [21], v podjetju pa se ukvarjajo tudi z RT-PCR testiranjem.

V luči ponovne analize protokola testa za identifikacijo SARS-CoV-2, opisanega v članku Corman-Drosten, smo našli številne napake in zmote, zaradi česar je SARS-CoV-2 PCR test neuporaben.

Reference najdete v objavljenem poročilu skupine na spletu.

Člani konzorcija:

• Dr. Pieter Borger, MSc, PhD, molekularni genetik, Lörrach, Nemčija
• Prof. Dr. Ulirke Kämmerer, specialistka virologije / imunologije / humane biologije / celične biologije, Würzburg, Nemčija
• Prof. Dr. Klaus Steger, oddelek za urologijo, pediatrično urologijo in andrologijo, molekularno andrologijo in biomedicinske raziskave, Giessen, Nemčija
• Prof. Dr. Makoto Ohashi, častni profesor in PhD iz mikrobiologije in imunologije, Univerza Tokushima, Japonska
• Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specialist radiolog, bolnica Collom Oschatz, Nemčija
• Rajesh K. Malhotra, bivši 3D umetnik / Center za molekularno medicino avstrijske akademije znanosti (2019-2020), Univerza za uporabne znanosti, Dunaj, Avstrija
• Dr. Michael Yeadon, BSs Biochem Tox U Surrey, PhD iz farmacije, bivši vodja oddelka,  Pfizer, Velika Britanija
• Dr. Kevin P. Corbett, MSc zdravstvene nege (Kings College London) in PhD socialnih znanosti (London South Bank), London, Velika Britanija
• Dr. Clare Craig MA, BM (Cantab), BCh (Oxon), FRCPath, Velika Britanija
• Kevin McKernan, BS Univerza Emory, vodja oddelka za medicinsko genomiko, ustanovitelj sekvencioniranja pri WIBR / MIT v človeškem genoma projektu, izumitelj SOLiD sekvence, nagrajen za patent vezan na PCR, izolacijo DNA in sekvencioniranje, ZDA
• Dr. Lidiya Angelova, MSc biologije, PhD mikrobiologije, bivša raziskovalka na Inštitutu za alergije in infekcijske bolezni, Maryland, ZDA
• Dr. Fabio Franchi, specialist za infekcijske bolezni, higieno in preventivno medicino, Italija
• Dr. med. Thomas Binder, internist, kardiolog, Švica
• Dr. Stefano Scoglio, BSc, PhD, mikrobiolog, nutricionist, Italija
• Dr. Paul McSheehy, BSc, PhD, biokemik in industrijski farmakolog, Loerrach, Nemčija
• Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens, MSc, PhD, specialist za laboratorijsko medicino, Beugen, Nizozemska
• Dr. Dorothea Gilbert, MSc, PhD, kemik in toksikolog, Oslo, Norveška
• Dr. Reiner Klement, PhD, radiolog, Schweinfurt, Nemčija
• Dr. Ruth Schrüfer, PhD, specialist za humano genetiko in imunologijo, Munich, Nemčija
• Dr. Berber W. Pieksma, splošni zdravnik, Nizozemska
• Dr. med. Jan Bonte, nevrolog, Nizozemska
• Dr. Bruno H. Dalle Carbonare, molekularni biolog, Basel, Švica